DNA lần đầu tiên được cô lập bởi thầy thuốc người Thụy Sĩ Friedrich Miescher, người mà vào năm 1869, đã khám phá ra một chất vi mô trong mủ của băng gạc được tháo bỏ sau phẫu thuật. Vì nó nằm trong nhân của tế bào, ông đã gọi nó là "nuclein".[185][186] Năm 1878, Albrecht Kossel đã cô lập được thành phần không phải là protein của "nuclein", axit nucleic, và sau đó ông cô lập được năm nucleobase cơ bản của nó.[187][188] Năm 1919, Phoebus Levene nhận biết được các đơn vị của nucleotide là base, đường và phosphat.[189] Levene đề xuất rằng DNA chứa một chuỗi các đơn vị nucleotide được liên kết với nhau bằng các nhóm phosphat. Levene đã nghĩ rằng mạch này là ngắn và các base lặp lại theo một thứ tự cố định. Năm 1937, William Astbury chụp được ảnh thành phần nhiễu xạ tia X đầu tiên cho thấy DNA có một cấu trúc đều đặn.[190]

Năm 1927, Nikolai Koltsov đề xuất rằng các tính trạng di truyền có thể được thừa hưởng thông qua một "phân tử di truyền khổng lồ" cấu thành từ "hai mạch đối xứng mà có thể sao chép theo cách bán bảo tồn sử dụng từng mạch như là một khuôn mẫu".[191][192] Năm 1928, Frederick Griffith trong thí nghiệm của ông đã khám phá ra các tính trạng dạng "trơn" của phế cầu khuẩn (Pneumococcus) có thể truyền sang dạng "thô" của cùng một loài vi khuẩn bằng cách trộn các vi khuẩn dạng "trơn" đã bị giết với các vi khuẩn dạng "thô" còn sống bằng thí nghiệm nổi tiếng gọi là thí nghiệm Griffith.[193][194] Hệ thống thí nghiệm này cung cấp gợi ý rõ ràng đầu tiên về DNA mang thông tin di truyền—theo thí nghiệm Avery–MacLeod–McCarty—khi Oswald Avery, cùng với các đồng nghiệp Colin MacLeod và Maclyn McCarty, nhận ra DNA tuân theo nguyên lý biến nạp trong thí nghiệm Griffith vào năm 1943.[195] Vai trò của DNA trong di truyền được xác nhận vào năm 1952, khi Alfred Hershey và Martha Chase trong thí nghiệm Hershey–Chase chỉ ra rằng DNA là vật liệu di truyền của thực khuẩn thể T2.[196]

Năm 1953, James Watson và Francis Crick lần đầu tiên đề xuất mô hình mà được chấp nhận ngày nay với cấu trúc DNA chuỗi xoắn kép đăng trên tạp chí Nature.[12] Mô hình phân tử chuỗi xoắn kép DNA của họ khi ấy dựa trên ảnh chụp nhiễu xạ tia X (còn gọi là "Ảnh chụp 51")[197] do Rosalind Franklin và Raymond Gosling thực hiện vào tháng 5 năm 1952, và dựa trên thông tin rằng các base DNA ghép cặp với nhau.

Chứng cứ thực nghiệm ủng hộ mô hình Watson và Crick được công bố trong một loạt 5 bài báo đăng trên cùng một số của tờ Nature.[198] Trong các bài báo này, bài viết của Franklin và Gosling là công trình đầu tiên của chính họ công bố dữ liệu về nhiễu xạ tia X và phương pháp phân tích gốc giúp ủng hộ một phần mô hình của Watson và Crick;[50][199] trong số báo này cũng bao gồm bài viết về cấu trúc DNA của Maurice Wilkins với hai đồng nghiệp của ông, khi họ thực hiện phân tích ảnh chụp tia X của dạng B-DNA trong cơ thể sống (in vivo) mà cũng ủng hộ cho sự có mặt trong cơ thể sống của cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA như đề xuất của Crick và Watson về mô hình phân tử DNA của họ trong bài báo dài 2 trang đăng ở số trước của tạp chí Nature.[51] Năm 1962, khi ấy Franklin đã qua đời, Watson, Crick, và Wilkins cùng nhận Giải Nobel Sinh lý và Y học.[200] Do điều lệ của Quỹ Nobel chỉ trao giải cho những nhà khoa học còn sống. Vẫn có những tranh luận về sau liên quan đến những ai xứng đáng được công nhận liên quan đến khám phá này.[201]

Trong một buổi nói chuyện có tầm ảnh hưởng vào năm 1957, Crick đưa ra luận thuyết trung tâm của sinh học phân tử, báo hiệu trước về mối quan hệ giữa các phân tử DNA, RNA, và protein, và khớp nối với "giả thuyết về dòng thông tin".[202] Chứng cứ thực nghiệm cuối cùng xác nhận cơ chế sao chép mà hàm ý cấu trúc chuỗi xoắn kép được công bố vào năm 1958 thông qua thí nghiệm Meselson–Stahl.[203] Những công trình về sau của Crick và các đồng nghiệp cũng như của nhiều nhà khoa học khác chứng tỏ mã di truyền có cơ sở là tổ hợp của bộ ba base không chồng lợp nhau, hay còn gọi là các codon, cho phép Har Gobind Khorana, Robert W. Holley và Marshall Warren Nirenberg làm sáng tỏ mã di truyền.[204] Những phát hiện này đã khai sinh ra ngành sinh học phân tử.